Genetyka molekularna metoda badawcza

W celu zbadania i zidentyfikować warianty w konstrukcji DNA stosowane cząsteczkową metody genetycznej. Dla każdego regionu DNA, który bada tego obszaru chromosomu genu lub allelu, metody różnią. W dany cząsteczkową metody genetycznej obejmuje niektóre lub innej manipulacji RNA i DNA. Wszystkie te metody charakteryzują się ogromną złożonością, bez warunkach laboratoryjnych nie można przeprowadzić, a personel musi być wysoko wykwalifikowany. Praca ta odbywa się w kilku etapach.

etapy

Po pierwsze, DNA, RNA lub próbki mają być produkowane. Tutaj, cząsteczkowej metodą genetyczny może być stosowana do praktycznie każdego materiału: kropla krwi, leukocyty, fibroblasty kultury śluzowej (ociera) nawet włosowych, – DNA można otrzymać z jakiejkolwiek próbki. Korzystne jest używać metod genetycznych, molekularnych i ich różne warianty i od dawna DNA jest przechowywana zamrożona. Drugi etap jest przeznaczony do gromadzenia pożądanych fragmentów (amplifikacji DNA), co pomaga zapewnić, reakcji łańcuchowej polimerazy w warunkach in vitro (in vitro bez udziału żywych organizmów). W rezultacie wybrana mnoży fragmentów DNA przez reakcję łańcuchową i rośnie ilość DNA Miliony razy.

Trzeci etap, w molekularnych metod badań genetycznych zakłada zwielokrotniany ograniczenie DNA (fragmentacji, rozerwanie albo cięcia). Ograniczenie wykonaniu elektroforezy w żelu poliakryloamidowym lub agarozowym. Ta genetyczna cząsteczkowej metodą badania fragment DNA umożliwia każdej osobie pewnej pozycji w żelu. Następnie, żel poddaje się obróbce bromkiem etydyny, zdolne do wiązania się do DNA, napromieniowanie światłem ultrafioletowym, to można obserwować części luminescencji. Genetyka molekularna metody diagnostyczne są różne i liczne, ale dwa pierwsze etapy są wspólne dla wszystkich. Jednak w celu identyfikacji fragmentów DNA, żel może być barwiony, a wielu innych istniejących metod.

gatunek

Najbardziej bezpośrednie i powszechne sposoby wykrywania mykobakterii może zawierać powyższą metodę uczenia cząsteczkowej DNA genetycznej. Jej istotą jest to, że w celu zidentyfikowania skanowania materiału łańcucha specyficznych fragmentów DNA z patogenów. Genetyka molekularna techniki diagnostyczne nie są jeszcze bardziej efektywny sposób rozpoznawania choroby, takie jak gruźlicę. Stosując reakcję łańcuchową polimerazy (PCR), można mieć pewność, że oryginalne DNA zwiększy liczbę kopii w milion razy, to znaczy, nie będzie wzmocnienie i wyświetli wyniki. Czułość jest bardzo duża – ponad dziewięćdziesiąt pięć procent, co jest ważną zaletą tego sposobu.

Reszta molekularnych metod genetycznych badań nad skutecznością plastyczności wielu kopii dosłownie dwukrotnie, ponieważ w tym przypadku, gdy próbka wykazuje opracowanie specyficznych sekwencji oligonukleotydowych wzrosła do stu sześć razy. Nawet diagnoza kultury gruźlicy układu oddechowego znacząco obniżyć jego czułość. Dlatego współczesna medycyna jest oparta na molekularnych metod genetycznych diagnostyce gruźlicy. A opisany sposób jest skuteczny zwłaszcza w przypadku patogenami wysokiej zmienności antygenowej, określa, że drugi sposób jest o wiele trudniejsze – wymaga specjalnych podłoży odżywczych i uprawy czasu. Biochemiczne i molekularna genetyczne wytwarzają bardzo różny wpływ na wyniki.

Rozpoznanie gruźlicy

Rozpoznanie Marshall PCR gruźlicy najczęściej stosując te sekwencje DNA, które są specyficzne dla wszystkich czterech typów choroby. Aby osiągnąć ten cel często korzystają starterów, które wykrywają sekwencja jest elementów (IS-986, IS-6110), a elementy te charakteryzują gatunków masowo migrujących Mycobacterium tuberculosis i zawsze obecny wielu kopii w genomie. Ekstrakcja DNA można także przeprowadzić z czystych kultur Klinicznej (plwociny od pacjentów) z zastosowaniem jakiejkolwiek innej odpowiedniej metody. Na przykład, sposób, w którym wysięgnik bufor lizy wykorzystania na podstawie tiocyjanianu guanidyny i krzemionki DNA nośnikowym. Liczba pacjentów, które różnią się słabe bakteriologicznych rośnie każdego roku, a więc w praktyce klinicznej ustanowił zupełnie inny poziom organizacji: metoda molekularnym genetyczne studiowania DNA został odgrywa ważną rolę w diagnostyce.

Musimy jednak przyznać, że nie jest bez wad. Metoda PCR jest stosowanie często przynosi ogromną liczbę wyników fałszywie dodatnich, a powodem jest nie tylko błędy techniczne, ale także cechy samego sposobu. Ponadto, stosując tę metodę rozpoznania do określenia żywotności prątki, które zostały zidentyfikowane, to jest po prostu niemożliwe. Ale ta wada nie jest najważniejsze. Molekularna genetycznej diagnostyki PCR pociąga za sobą ryzyko zakażenia prątkowe DNA. wymagania certyfikacyjne dla tej przyczyny, że dla laboratoriów PCR zaprojektowany specjalnie trudne, wymagają one trzy oddzielne pomieszczenia. Technika PCR jest nowoczesny i bardzo skomplikowane, wymaga użycia odpowiedniego sprzętu i wysokiej przeszkolony personel.

bacterioscopy

Gdy wyniki diagnozy analizy muszą być porównywane z innymi danymi: badanie kliniczne, radiografii, rozmaz mikroskopii, rośliny, a nawet odpowiedzi na konkretne leczenie są bardzo ważne. W tej serii, badania PCR jest tylko jednym z elementów. Wykrycie patogenu we wczesnej diagnostyce może być najprostsze i najszybsze metody – bakteriologiczne.

Nie stosuje się mikroskop świetlny (zabarwienie Ziehl-Neelsena i) fluorescencyjny (zabarwienie fluorochromy). Zaletą jest szybkość rozmaz wyników. Ale jego wadą jest słusznie uważany za ograniczone możliwości ze względu na niską czułość. Jednak metoda ta jest podana zalecenia WHO jako najbardziej ekonomiczny i ziemi w celu wykrycia chorych na gruźlicę. Wykrywanie prątków metodą bakteriologiczną ma wartość predykcji i szacowany wydalanie ilościowo bakterii. Znacznie bardziej pewni siebie, aby sobie z tym poradzić genetyka molekularna metod badawczych gruźlicy.

kultury

Lepsze wykrywanie prątków rozpoznać kulturoznawstwo. Wysiewie materiału patologicznego jest wykonana na podłożu z jaj: Mordovsky Finn II, L.J., i tym podobne. Benchmarki oporności prątków na leki i pośrednie dowody skuteczności szeregu prątki i ich kolonii in vitro, jeśli zastosowanej metody badawczej kultury. W celu zwiększenia procentu wydzielania prątków inokulacji materiału patologicznego odbywa się w wielu środowiskach.

Wychodząc naprzeciw potrzebom wielu patogenów kulturowego, w tym dotacji i płynów. Stosowane w tym systemie i zautomatyzowane typ dozujący VANTES wzrostu. Uprawy muszą być utrzymywane w inkubatorze na okres do siedmiu do ośmiu tygodni. W tym czasie rośliny z brakiem wzrostu można uznać za negatywny. Najbardziej efektywnym sposobem wykrywania Mycobacterium tuberculosis uważa próbki biologiczne: diagnostyczny infekować świnki morskie, które są bardzo wrażliwe na TB.

Niektóre dane

Ciekawe pole badania, które zostało otwarte poprzez diagnostykę PCR było zbadanie M. tuberculosis – utajonej infekcji. Nowoczesna koncepcja zakażenia TB sugeruje, że na stu ludzi, którzy byli w kontakcie z M. tuberculosis, dziewięćdziesiąt mogą również być zainfekowane, ale tylko dziesięć z nich jest aktywna choroba jest rozwijany. Inni TB odporność, a ponieważ Dziewięćdziesiąt procent przypadków zakażenia pozostaje utajony. Wykrywania wzorca pomogło cząsteczkowy metodę genetycznej.

Genetycy że pięćdziesiąt pięć procent tych, których rośliny patologiczne materiału były ujemne, osiemdziesięciu procent osób zakażonych M. tuberculosis, ale płynie bez radiologicznych objawy choroby PCR pozytywnych odpowiedzi odbierane. Jest to metoda diagnostyczna genetyczne pozwoliły na zidentyfikowanie pacjentów zagrożonych przez badania PCR z wyników tych analiz (mikroskopowe i hodowlę) były ujemne, a subkliniczne zakażenie M. tuberculosis były obecne.

Współczesne badania

Federacji Rosyjskiej i bakteriologiczne laboratoriom szybszej metody bezwzględne stężenie: azotanu aktywności reduktazy prątków badanych przez reagent Griessa. ośrodki anty-TB stosować metodę, która pozwala na określenie lekooporności. Ten siew w mediach ciekłych, gdzie zautomatyzowane radiometryczne i system księgowy fluorescencyjny wzrost prątków. Taka analiza jest wykonywana szybko – do dwóch tygodni.

Obecnie opracowywane są nowe metody: lekooporności prątków jest mierzona na poziomie genotypu. Badania mechanizmów molekularnych genów oporności i pokazuje obecność w prątków. Te geny są związane z opornością na niektóre leki. Na przykład, geny kasa, inhA, katG oporne na izoniazyd, rifampicyna genu rpoB – 16SP genów RNA rpsL – streptomycyny emb1 – do etambutol, GyrA – fluorochinolon i tak dalej.

mutacje

Nowoczesny diagnozy znacznie zwiększona sposób poziomie molekularnym genetyczne do badania DNA i pozostawiono do przeprowadzania analiz na dużą skalę mutacji we wszystkich ich widma. Teraz wiemy, że najczęstsze mutacje w 516, 526 i 531 kodonów Gen rpoB i zidentyfikowane odporność na różne leki. Istnieje cała gama metod typowania prątków z wykorzystaniem nie tylko tradycyjnych metod – biochemicznych, biologicznych i kulturowych, ale również szeroko stosowane w nowoczesnych technik molekularnych genetyczne. Już nie są wystarczające i zapewnia prawidłowy sposób diagnostyczny do wykrywania choroby monogenicznych. Są one oparte na badaniach DNA w dokładnym obszarze danego genu. Zazwyczaj jest to skomplikowany proces, czasochłonne i kosztowne, ale dane dostarczane przez cząsteczkowy analizy genetycznej, jest bardziej dokładna i informacji niż dane wszystkich innych analizach.

Od dawna wiadomo, że DNA nie zmienia się przez cały okres organizmu, że jest w żaden komórek jądrzastych odnakova, a to sprawia, że jest to możliwe do podjęcia analizy absolutnie wszystkich komórkach organizmu, na każdym etapie rozwoju osobniczego. Uszkodzony gen może zostać wykryta przed pojawieniem się pierwszych objawów do objawów klinicznych na pełną skalę, a także u zdrowych osób heterozygotycznych, ale posiadające mutację w genie. Metody diagnostyki molekularnej genetycznej chorób dziedzicznych pozwala ujawniać (bezpośrednie podejście, DNA-Diagnostics), a także do analizy segregacji choroby w rodzinie z loci markera DNA (polimorfizm genetyczny), które są ściśle związane z uszkodzonym genem (tj pośredni Podejście DNA Diagnostics). Bezpośrednio lub pośrednio – wszelkie diagnostyki DNA w oparciu o metody identyfikacji ściśle określoną część ludzkiego DNA.

metody bezpośrednie

Bezpośrednie sposoby diagnozowania DNA jest gdy gen winny dziedziczna choroba jest znana, co jest dobrze znane, oraz rodzaje jego mutacji. Na przykład, odpowiednie metody bezpośredniej w szeregu chorób. Ten pląsawica Huntingtona (rozszerzenie CTG-powtórzeń), fenyloketonuria (R408W), mukowiscydoza (delF508, główne mutacje) i tym podobne. Główną zaletą tej metody bezpośredniej jest w całości własnością dokładność diagnostyczną, i nie ma potrzeby, aby wykonać analizę DNA z resztą rodziny. Jeśli mutacja genu odpowiadającego zostanie znaleziony, to pozwala dokładnie zatwierdzić diagnozę dziedziczności, determinacji genotypu dla reszty obarczony rodziną.

Kolejną zaletą bezpośredniego diagnozowania uważany jest zidentyfikowanie heterozygotycznych nośnik złych mutacji od krewnych i rodziców, którzy zmarli z powodu tej choroby. Jest to szczególnie prawdziwe w odniesieniu do choroby autosomalny recesywny. Wady metod bezpośrednich również są dostępne. Aby je zastosować, trzeba wiedzieć dokładnie zlokalizować nieprawidłowy gen, strukturę egzon-intron jego widma i jego mutacji. Nie wszystkie choroby monogenowe dzisiaj otrzymaliśmy taką informację. Informatywności Metody bezpośrednie nie może być uznana za zakończoną, ponieważ jeden i ten sam gen może mieć dużą liczbą stanów patologicznych mutacji, które powodują rozwój chorób dziedzicznych.

metody pośrednie

Metody pośrednie w diagnostyce DNA są w ogóle stosowane w innych przypadkach, jeśli uszkodzony gen nie został zidentyfikowany, ale tylko chromosomem lub jeśli diagnoza linia nie daje wynik (to się dzieje, jeśli gen złożona organizacja molekularna lub w dużym stopniu, jeśli istnieje wiele patologicznych mutacji). Metody pośrednie przeprowadzono analizę segregacji markerów polimorficznych do rodziny allilowe. Markery znajdują się w tym samym regionie chromosomalnym lub lokus jest ściśle związana z chorobą i stanowią delecje lub insercje, substytucje punktowe, powtórzenia i ich polimorfizm ze względu na różne ilości komórek w bloku.

Najwygodniejszym dla pośrednich diagnoza uważane mikrosatelitarnych i ministaelitarnych polimorfizmów, które są szeroko rozpowszechnione w ludzkim genomie. ich wartość wyrażona w dużej zawartości informacyjnej, jeśli uszkodzenie odległości genetycznej pomiędzy markerem i genem nie jest zbyt duża. W tym ostatnim przypadku, dokładność oszacowania określa się w dużym stopniu częstości rekombinacji pomiędzy polimorficznych markerów i uszkodzeniem. Pośrednie metody diagnostyczne służą również obowiązkowy etap wstępny częstości alleli w populacji badania badanej grupie pacjentów i nosicieli mutacji, a także konieczność określania prawdopodobieństwa rekombinacji nierównowagowych i adhezji markerów i zmutowanych alleli.

inne metody

Krótkie odcinki RNA lub DNA, a także jednego genu wizualizowano w badaniu mikroskopowym, nie może być w związku z tym, w celu określenia mutacji konieczne diagnostyki molekularnej genetycznej. Istnieje „Human Genome Project”, jak również inne związane z genetyki molekularnej znacznie rozszerzyć możliwość diagnozy chorób genetycznych – zarówno przed jak i po urodzeniu. Metody te umożliwiają wczesne wykrycie i dokonać poli- predykcji oraz chorób, których monogenicznej debiut odbywa się w wieku dorosłym. Niestety, ze względu na możliwości techniczne molekularnych badań genetycznych są czasami poza granice etyczne, które są ustawione w stosunku do dziedziczenia, zwłaszcza, gdy diagnoza jest w młodości i dzieciństwa.

aberracje chromosomowe strukturalne i liczbowe są najczęstszymi przyczynami chorób i nowotworów, a wiele wad. Aberracje chromosomowe należy określić, co jest ważne dla poradnictwa rodzinnego – w celu oceny prognozy, wraz z ryzykiem reprodukcyjnego w kolejnych ciążach. analiza chromosomów jest „złoty standard” diagnostyki genetycznej, ale jest ograniczona. Tylko metody cząsteczkowego analizy genetycznej mogą więcej, ponieważ nie stosuje się do klonowania technologia oparta znaczniki fluorescencyjne zdolne do ich wysokiej czułości do identyfikacji niewielkich zmian chromosomalnych, które są możliwe do wykrycia klasycznych badań cytogenetycznych. Techniki te są coraz bardziej rozszerza nasze możliwości diagnostyczne, gdy badane dzieci z zaburzeniami rozwojowymi, upośledzeniem umysłowym, z wieloma innymi chorobami dziedzicznymi.

odkrycia

Jest to bardzo ważne dla człowieka oraz struktura genu i funkcji wiedzy typy zmienności zdolność do wykrywania chorób dziedzicznych, które wystąpiły w związku z rozwojem genetyki molekularnej. Metody fizyczne mające na celu badania cząsteczki DNA – i, gdy jest to normalne, a gdy jest uszkodzony. Wytwarzanie sekwencji nukleotydów kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA), rozciąga się w etapach od przyjmowania próbki do identyfikacji poszczególnych fragmentów. Izolacja genomowego DNA z komórek restrykcyjnych (rozrywanie), wzmocnienie (klonowania), elektroforeza fragmentów (oddzielenie swój ładunek elektryczny i masy cząsteczkowej w żelu agarozowym). Określenie konkretnych fragmentów znajdujących się na powierzchni dyskretnych pasków.

Następnie zaczynają reagować specjalnych filtrów, przez które przechodzi każda hybrydyzację fragmentu klonowanego DNA lub fragmentów syntetycznych sond radioaktywnych jest sterowanie, które jest równe próbki. W przypadku zmiany położenia lub długości w porównaniu z sondą, jeżeli nowy fragment lub znikły – wszystko to wskazuje, że gen analizuje się restrukturyzację w sekwencji nukleotydowej. Istnieje osiem podstawowe techniki molekularne genetyczny sekwencjonowania (oznaczenie sekwencji DNA), reakcja łańcuchowa polimerazy (wzrost liczby sekwencji) przygotowanie starterów znanych genów klonowania DNA, białka wytwarzania rekombinowanych cząsteczek pochodzących z powodu rekombinowanych cząsteczek, tworząc kompletny zestaw (kolekcja biblioteka) sklonowane fragmenty, które zostały uzyskane za pomocą ograniczenia.