mikroskopii fluorescencyjnej: zasady metody

Absorpcja i ponownego emisji światła kolejnych cieczy nieorganicznych i organicznych jest wynikiem fosforescencję i fluorescencję. Różnica pomiędzy zjawiskiem jest czas trwania przedziału pomiędzy absorpcji i emisji światła topnika. Kiedy fluorescencja tych procesów występują niemal jednocześnie, natomiast fosforescencji – z pewnym opóźnieniem.

informacje historyczne

W 1852 roku brytyjski naukowiec Stokes, po raz pierwszy opisany fluorescencję. On wprowadził nową kadencję w wyniku eksperymentów z fluorytu, które emitują światło czerwone w świetle ultrafioletowym. Stokes zauważyć ciekawe zjawisko. Stwierdzono, że długości fal promieniowania fluorescencyjnego jest zawsze większy niż przepływ światła wzbudzenia.

Aby potwierdzić hipotezę w 19 wieku było wiele eksperymentów. Pokazali, że wiele próbek fluoryzują pod wpływem światła ultrafioletowego. Wśród materiałów, między innymi, zostały kryształy, żywic, składników mineralnych, chlorofil, leków roślinnych, nieorganicznych związków, witamin, olejów. Bezpośrednie stosowanie barwników do badań biologicznych rozpoczęła się dopiero w 1930 roku

mikroskopii fluorescencyjnej: opis

Niektóre z materiałów używanych w pierwszej połowie lat 20-wiecznych badań wykazywały wysoką specyficzność. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Dzięki wydajności, który nie mógłby być osiągnięty przez kontrastujące metod, metoda mikroskopii fluorescencyjnej stała się niezbędnym narzędziem w badaniach biomedycznych i biologicznych. Równie ważne wyniki uzyskano, a dla materiałów.

? Jakie zalety ma metodę mikroskopii fluorescencyjnej? Korzystanie z nowych materiałów stało się możliwe, a wybór bardzo specyficznych komórek submikroskopowej komponentów. Mikroskopii fluorescencyjnej wykrywa pojedyncze cząsteczki. Różnorodność barwniki pozwalają na identyfikację wielu elementów naraz. Pomimo ograniczonej rozdzielczości przestrzennej limitu dyfrakcji urządzenia, która z kolei zależy od konkretnych właściwości próbki, identyfikacja cząsteczek poniżej tego poziomu jest całkiem możliwy. Różne próbki po napromieniowaniu wykazują autofluorescencji. Zjawisko to jest powszechnie stosowane w PETROLOGIA, botanika, przemyśle półprzewodnikowym.

funkcje

Badanie tkanek zwierzęcych lub patogenów często skomplikowane lub zbyt słabych i mocnych niespecyficzne autofluorescencji. Jednakże wartość w badaniach uzyskuje wprowadzenie do składników materiałowych wzbudzany przy określonej długości fali i emitowania światła niezbędnego natężenie przepływu. Fluorochromy działać jako barwniki zdolne niezależnie przyłączonych do struktury (widoczny lub niewidoczny). Zatem mają one wysoką selektywność w stosunku do celu, a wydajność kwantową.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Mikroskopia fluorescencyjna została szeroko stosowany od nadejściem barwników naturalnych i syntetycznych. Posiadały one pewne profile intensywności emisji i wzbudzenia i kierowane do określonych celów biologicznych.

Identyfikacja poszczególnych cząsteczek

Często, w idealnych warunkach, można zarejestrować oddzielny element blask. W tym celu, między innymi, konieczne jest zapewnienie wystarczająco niski poziom hałasu detektora a tłem optycznego. Cząsteczka fluoresceiny na niepowodzenie ze względu na wygaszanie może emitować nawet do 300 tys. Fotonów. Przy 20% wydajności procesu zbierania i może zarejestrować się je w ilości około 60.000.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. mikroskopia fluorescencyjna fotodiod lawinowych na podstawie elektronicznej lub mnożenia, pozwoliła naukowcom obserwować zachowanie pojedynczych cząsteczek przez sekundę, a w niektórych przypadkach nawet minuty.

złożoność

Kluczową kwestią na rzecz tłumienia optycznego tle szumu. Ze względu na fakt, że wiele materiałów użytych w konstrukcji filtrów i soczewek wykazują pewne autofluorescencji, wysiłki naukowców na wczesnym etapie były zorientowane na produkcję elementów o niskiej fluorescencji. Jednak późniejsze eksperymenty doprowadziły do nowych wniosków. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. W szczególności stwierdzono, że mikroskopię fluorescencyjną, na podstawie całkowitego odbicia wewnętrznego, pozwala uzyskać niskie tło oraz wysokiej intensywności światła wzbudzenia.

mechanizm

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Zasady mikroskopię fluorescencyjną, na podstawie całkowitego odbicia wewnętrznego jest stosowanie lub zanikającej fali zanikającej. Występuje on na granicy między mediów o różnych współczynnikach załamania. W takim przypadku, wiązka światła przechodzi przez pryzmat. Ma parametr wysoki współczynnik załamania.

Pryzmat przylega do wodnego roztworu lub szkła o niskiej parametru. Jeżeli promień światła skierowane na nią pod kątem, który jest bardziej krytyczne, to belka jest całkowicie odbijana od interfejsu. Zjawisko to z kolei powoduje, że fale nonpropagating. Innymi słowy, pole elektromagnetyczne generowane który wnika w środowisku o niższej parametru współczynnika załamania światła na odległości mniejszej niż 200 nanometrów.

Zanikającej fali natężenie światła będzie wystarczające do pobudzenia fluoroforów. Jednakże, ze względu na jego bardzo małej głębokości, jej wielkość będzie bardzo mała. Rezultatem jest niski poziom tła.

modyfikacja

Mikroskopia fluorescencyjna jest na podstawie całkowitego wewnętrznego odbicia, mogą być realizowane z epi-iluminacji. Wymaga to soczewki o dużej aperturze numerycznej (co najmniej 1,4, przy czym pożądane jest, by osiągnęła 1.45-1.6) i częściowo oświetlone urządzenia pola. Te ostatnie uzyskuje się w małej wielkości plamki. Dla większej jednorodności za pomocą cienkiej pierścień, który jest zablokowany przez część strumienia. W krytycznym kącie, po którym następuje całkowite odbicie, trzeba wysoką załamania medium zanurzenia w soczewkach i pokrywy szklanej mikroskopu.